也谈新型冠状病毒特异抗体检测的

　　新型冠状病毒（2019nCoV）特异IgM和IgG抗体检测写进了国家卫生健康委于2020年3月3日发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版），作为临床确诊标准，国家药品监督管理局（NMPA）也应急审批了广州万孚（胶体金试纸条）、英诺特（唐山）（胶体金试剂条）、博奥赛斯（重庆）（化学发光免疫法）和厦门万泰凯瑞（化学发光免疫法）等四家企业的五个抗体检测试剂盒，其中广州万孚和厦门万泰凯瑞检测的是抗新型冠状病毒总抗体，其他两家检测的是IgM和IgG抗体，临床已开始广泛应用这些试剂对患者进行检测，其他一些正申请审批的试剂如获得CE认证的深圳亚辉龙的IgM和IgG抗体试剂（化学发光免疫法）也在临床大量应用。徐万洲等在19例核酸检测阴性但基于临床症状确诊的COVID19患者中，有16例患者2019nCoVIgM阳性，其阳性率达到84。21，有18例患者2019nCoVIgG阳性，其阳性率达到94。74，说明抗体的检测可以有效地弥补核酸检测漏检的风险，发挥其在新型冠状肺炎（COVID19）的及时诊治及防控中的作用。但临床现也有反映出现了较多的假阳性，困扰临床决策。2019nCoV特异IgM和IgG抗体检测出现假阳性的原因是什么？如何最大程度的识别假阳性并避免假阳性对临床的误导？以及在临床应用中，究竟要如何去用才能最有效地发挥其对2019nCoV感染的诊断和防控价值？是一个必须要直接面对并且无法回避的问题。
　　一、2019nCoV特异IgM和IgG抗体的诊断意义
　　从机体对病原体的体液免疫应答来看，病原体的特定蛋白如2019nCoV的S蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答，最早出现的抗体是IgM及其后的IgA抗体，然后是IgG抗体，从急性感染的一般过程，当IgG抗体出现后，浓度会持续增高，IgM则持续降低，直至消失，IgG抗体会较长时间存在。因此，特异IgM和IgG抗体是一对出现有序，此消彼长的一个关系。所以我们曾提出，正确地利用及观察IgMIgG的动态变化（如图1），有助于在病毒核酸检测这个临床诊断金标准失效后（因病程、标本采集等所致的假阴性）的2019nCoV感染的诊断。
　　那为什么一定要是动态的，而不能是静态的检测一次呢？这是由免疫检测的特性所决定的，也就是抗体检测会因为临床标本中的一些干扰物质的存在而出现假阳性结果。也许有同道要问，那为什么我们检测乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）等则可以静态只检测一次呢？其实也不是一次，这些病毒感染主要为慢性感染，无法如上述急性感染那样去动态观察确认，只能是通过如下办法确证：如HBV有多个标志物（如两对半），可相互确认，出现罕见的单独HBsAg阳性，则有中和实验确证；抗HCV和抗HIV阳性，也必须经过确证实验如病毒核酸检测或免疫印迹实验后，才能报出阳性结果。
　　图1。IgMIgG用于判断急性或近期感染的动态检测及判断方法
　　二、IgM和IgG抗体检测假阳性的原因以及如何最大程度的避免
　　特异IgM和IgG免疫测定假阳性通常有以下两个方面的原因，一是试剂盒阳性判断值（Cutoffvalue）的设定，一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果，很可能是假阳性；其二是患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质。
　　（一）阳性判断值的设定
　　胶体金试纸条检测是通过肉眼观察颜色有否来判断阳性和阴性，不存在阳性判断值的问题，但会存在不同检测者判断的差异。化学发光免疫试验（CLIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）则需要设定阳性判断值，其较好的做法是通过测定大量的阴性人群（可数千份）和一定数量（可数百份）的已知阳性人群标本，会得到如图2的一个分布，采用接受机工作特性（ReceiverOperatingcharacteristic，ROC）曲线或其他统计学方法得到的阳性判断值，通常为假阳性和假阴性均较低且达到平衡状态时的测定信号如OD值或发光值。因此，不可避免处于其周边阳性一侧的结果，会有一部分弱阳性其实际为假阳性。
　　图2。依据阴性和阳性人群检测值的分布确定阳性判断值
　　（二）干扰物质
　　1。内源性内源性干扰物质一般包括类风湿因子、嗜异性抗体、补体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体等。在日常的临床血清（浆）标本中，有相当比例的标本不同程度的含有上述各种干扰物质，从而可能导致测定结果的假阳性。
　　（1）类风湿因子（Rheumatoidfactors，RF）
　　在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF，其通常为IgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因此在免疫测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的标记的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。
　　为避免RF的干扰，通常可采取以下措施：1）稀释标本。这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体检测等尤为有用。因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低很多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成很低的滴度，从而不影响测定。2）改变酶标抗体。由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将标记抗体的Fc片段酶切去除，仅留下具有特异结合功能的F（ab’）2部分用于标记，则在测定中即可避免RF的干扰。3）标本中RF用变性IgG预先封闭。将经热变性（63，10min）的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。4）测定时，可在标本中加入一定浓度的尿素，其可以解离低亲合力结合的RF和IgG，因而可以去除RF的干扰。
　　（2）嗜异性抗体（Heterophilicantibodies）
　　人类血清中可能会含有抗啮齿类动物（如鼠、马、羊等）的抗体，即天然嗜异性抗体。有研究表明，天然的嗜异性抗体（IgG）可分为两类，一类（85的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。另一类（15的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC区表位结合。嗜异性抗体可通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳性反应。
　　由嗜异性抗体引起的干扰可通过下述方法避免：1）使用特异的兔F（ab’）2片段作为固相或测定标记抗体。2）在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的嗜异性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。
　　（3）补体
　　在固相免疫测定中，来自哺乳动物的固相特异抗体和标记二抗均可以激活人补体系统。因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。
　　由补体引起的干扰可采用5630min加热可使标本中的补体C1q灭活。但实施前，一定要有实验证明这种灭活不会影响特定试剂的检测结果。
　　（4）因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体
　　在临床上，有可能使用鼠源性单克隆抗体进行靶向治疗，及使用放射性核素标记鼠源性单克隆抗体进行影像诊断等，均有可能使相应患者体内产生抗鼠抗体。这种抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定，可产生假阳性结果。
　　由抗鼠抗体引起的干扰可通过下述方法避免：1）使用特异的抗体F（ab’）2片段作为固相或测定酶标抗体。2）在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。
　　（5）溶菌酶
　　溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为5，因此，在免疫测定中，溶菌酶可在包被的IgG和标记的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。Cu2离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。
　　2。外源性外源性干扰物质包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等。
　　（1）标本溶血
　　要注意避免出现严重溶血。血红蛋白的血红素基团有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA和CLIA中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其在温育过程中会吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色或发光，导致假阳性。
　　（2）标本贮存时间过长标本在28下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。
　　（3）标本凝固不全血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，1824h完全凝固。日常检验中，有可能在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的血清并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。因此，血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
　　综上所述，尽管从方法学设计及临床应用中，通过一些方法和措施可以大大减少IgM和IgG抗体检测的假阳性，但无法完全避免。
　　三、如何才能最有效地发挥特异IgM和IgG抗体检测对新冠病毒感染的诊断和防控价值
　　任何一个临床检测项目，都是为了特定患者人群在其疾病发生发展过程中某个特定时间的疾病的诊断或治疗的，简单的讲，就是要对正确的患者（who）在正确的时间（when）开出正确的检验申请单（what）。那么，2019nCoV特异的IgM和IgG抗体只能是用于在临床疑似COVID19且病毒核酸检测阴性时，为明确诊断，可按照图1所示动态多次（2次以上）检测患者，通过动态变化来判IgM和IgG检测阳性的真假，从而避免假阳性结果对临床诊断的误导。当然，对于临床疑似患者，特异IgM和IgG抗体的检测也可与病毒核酸检测同时进行，当核酸检测为阴性时，抗体检测出现图1中的四种模式的任何之一，不管后续的核酸检测是否阳性，只要是真正的病毒感染者，应基本上都可以通过后续的抗体动态检测出现的结果模式明确诊断。此外，针对2019nCoV刺突（S）蛋白的抗体具中和病毒的作用，采用S蛋白作为抗原的检测到的IgG抗体的出现并持续升高，应具有很好的预后及康复指示价值。
　　要注意的是，现在出现了将特异抗体的检测大规模用于复工或一般人群筛查的现象，是不可以的，其原因就是因为上述假阳性的出现是无法完全避免的。一般人群筛查，一旦出现阳性，会造成大量人群不需要的隔离，带来混乱。并且，抗体检测阴性，也不能排除2019nCoV的感染。所以这种筛查的成本效益极低。NMPA在已批准的2019nCoV的特异抗体试剂盒说明书中的预期用途中都明确写出：仅用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据，不适用于一般人群的筛查。
　　综上所述，COVID19特异IgMIgG抗体完全可以作为COVID19在病毒核酸检测阴性情况下的确诊标准，其前提是需要2次以上的动态检测，以避免因标本中RF等免疫测定干扰物质的存在所致的假阳性结果的误导。正因为有这种假阳性的存在，特异IgMIgG抗体检测不适用复工等一般人群的筛查，这是必须要强调的。
　　参考文献（略）