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在肾癌组织中的表达及其临床意义


  刘泰荣 陈华 宋乐明
  [摘要]目的 探讨miR-155肾癌组织中的表达临床意义。方法 应用实时荧光定量(RT-PCR)技术检测21例肾癌组织及配对癌旁正常肾脏组织标本中miR-155的表达水平,并分析与肾癌临床病理参数间的关系。结果 肾癌组织中miR-155表达为(12.63±6.22),明显高于癌旁正常肾组织的(2.71±1.38)(P<0.01);肾癌组织中miR-155表达与临床分期、分化程度、性别、年龄及肿瘤直径无关(P>0.05)。结论 肾癌患者癌组织中的miR-155的表达较癌旁正常组织明显增高,但其表达水平与肾癌的病理分级和临床分化程度无明显相关性。
  [关键词]肾癌;miR-155;实时荧光定量PCR;表达
  [中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2018)10(a)-0082-03
  [Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-155 in renal cell carcinoma. Methods Real-time quantitative analysis (RT-PCR) was used to detect the expression of miR-155 in 21 renal cell carcinoma tissues and matched normal renal tissues. The relationship between its expression and clinicopathological parameters of renal cell carcinoma was analyzed. Results The expression of miR-155 in renal cell carcinoma was (12.63±6.22), which was significantly higher than that in adjacent normal renal tissues, (2.71±1.38) (P<0.01). The expression of miR-155 in renal cell carcinoma was not related with the clinical stage, degree of differentiation, gender, age, or tumor diameter (P>0.05). Conclusion The expression of miR-155 in cancer tissues in patients with renal cell carcinoma is significantly higher than that in adjacent normal tissues, but without correlation of the pathological grade or clinical differentiation of renal cell carcinoma.
  [Key words] Renal cancer; MiR-155; Real-time fluorescent quantitative PCR; Expression
  腎癌又称肾细胞癌,是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,占肾脏恶性肿瘤的80%,占成人恶性肿瘤的2%~3%,在我国肾癌发病率仅次于膀胱癌,居泌尿系统瘤第2位,在过去20年里发病率以每年2.5%的速度递增,并向低龄化发展,每年大约有2.7万例新发病例,11万例患者死于该病[1-2]。肾癌目前依然以手术治疗为主,常规放化疗铺助治疗,但均不能取得令人满意的效果。血尿、疼痛和包块是肾癌的主要症状,50%~60%的患者在发病初期无明显症状,在症状出现或确诊时已近中晚期,已错过治疗最佳时机[3-4]。因此寻找灵敏度高、特异性好的标志物辅助临床诊断并评估病情严重程度,对改善患者预后,提高患者生存率具有重要意义[5-6]。MicroRNAS(miRNAs)是一类重要的非编码RNA,最先由Lee等于1993年在线虫体内发现,广泛存在于动、植物中,可通过多种机制调节蛋白编码基因的表达,如通过降解或抑制靶基因的转录发挥作用。越来越多的证据表明[7-8],许多肿瘤的发生、发展与miRNAs的表达相关,如Juan等[9]研究发现多种miRNA在肾细胞癌中表达异常,其中miR-155在肾癌细胞中高表达。但是目前关于miR-155与肾癌发生、发展的相关报道较少。本研究采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测肾癌组织及癌旁正常肾组织中miR-155的表达,探讨miR-155在肾细胞癌发生、发展中的作用。
  1资料与方法
  1.1一般资料
  选取赣州市人民医院泌尿外科2016年1~6月收治的21例行肾癌治疗患者的肾癌及距离肾癌3~5 cm的癌旁正常肾组织标本。样本均预留2份,其中一份离体10 min内放液氮灌中冻存,以防RNA裂解;另一份放于福尔马林溶液中保存,用于病理诊断。本研究21例患者中男13例,女8例;年龄36~71岁,中位年龄52岁。所有患者临床病理学资料完整,术前均未行放化疗,术前检查确定无远处转移。
  1.2主要试剂
  Trizol、逆转录酶及二硫代苏糖醇(DTT,购自美国Qiagen公司);随机引物、dNTP、HS ExTaq酶等(购自日本Takara公司);Calibration、SYBR I(购自美国Bio.Rad公司);RNasin(购自美国Promega公司);引物则由上海生物工程技术服务有限公司合成。
  1.3总RNA提取及检测
  樣本切成薄片,在液氮中碾碎至粉状,按Trizol试剂说明书提取总RNA,DEPC处理过的蒸馏水溶解。琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性。
  1.4 miR-155表达分析
  miR-155的正向特异性引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGGGCA ATTCAGTTG AGCCCCTACT -3′。1 μg总RNA以茎环引物进行逆转录,反应条件为:25℃ 10 min,42℃ 60 min,52℃ 15 min,70℃ 15 min,反应结束后-20℃保存。PCR扩增上游引物为:5′- TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3′,下游引物为:5′-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3′,PCR扩增条件为:95℃变性5 min后,95℃ 30 s,60℃ 30 s,68℃ 30 s,22个循环,PCR产物大小63 bp。U6内参PCR以oligo dT逆转录的cDNA为模板,U6上游引物为5′-CTCGC TTCGGCAGCACA-3′,下游引物为5′-AACGC TTCAC GAATTTGCGT-3′。PCR扩增 条件为:95℃变性5 min后,95℃ 30 s,56℃ 30 s, 68℃ 30 s,25个循环。PCR产物大小94 bp。RT-PCR反应条件:95℃ 10 min变性;95℃15 s,60℃ 1 min,40个循环。设立3个复孔、记录反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数(Ct值),设定U6为内参照,采用定量PCR中的相对定量法测定相对表达量,其中ΔCt=(CtmiR155-CtU6)。
  1.5统计学方法
  采用SPSS 17.0进行统计分析,肾癌组织与癌旁正常组织miR-155的表达比较采用Mann-Whitney U检验,不同病理特征中表达比较采用Kruskal-Wallis H检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2结果
  2.1肾癌组织与癌旁正常组织miR-155表达的比较
  21例肿癌组织中的miR-155的相对表达量为2.17~24.85,平均(12.63±6.22),显著高于癌旁正常组织的(2.82±1.25),差异有统计学意义(t=11.521,P=0.016)。
  2.2不同病理特征表达的比较
  miR-155的表达与临床分期、分化程度、性别、年龄及肿瘤直径无关,差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
  3讨论
  肾脏位于人体隐蔽位置,且早期肾癌体积较小,症状多不典型肾脏病变早期不易发现,根据症状诊断较为困难,约1/3的患者初次诊断时已经扩散或转移[10-11]。肾癌的生物学行为及特征较为复杂,其发生发展机制尚未完全明确,目前主要考虑肾细胞癌的危险因素包括吸烟、肥胖、职业、城乡和文化经济状况、饮酒和食物、放射和药物及其他慢性肾病患者等[12-13]。肾癌缺乏有效的治疗措施,预后不理想,患者5年生存率不足10%,局限性肾癌首选外科手术治疗,根治性切除术已被公认可能治愈肾癌,然而对于局部进展性肾癌,手术后仍有1/3患者会发生远处转移,此类患者难以通过外科手术延长生存期,传统放化疗亦不敏感,对于转移的患者,以内科治疗为主,免疫疗法作为内科治疗中最为有效的治疗方式,具有增强免疫和抗肿瘤的效果,但价格昂贵且毒副作用大[14]。因此对于肾癌发生、发展过程中关键基因的研究,寻找可能存在的肾癌分子治疗靶点,具有非常重要的意义。
  micorRNA是近年研究热点,是一种长度为21~25 nt,具有基因调控功能的内源性非编码小RNA,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等过程[15-16]。研究发现,microRNA作为一种重要的转录后因子参与了肿瘤相关基因的调控[17-18]。而miR-155作为micorRNA家族中的一员,是较早被证实具有促癌作用的miRNA之一,在大多数血液系统恶性肿瘤和实体瘤中均呈高表达,如白血病、胰腺癌等[19-20]。在肾细胞癌中,miR-155的表达异常升高[21-22],但对于miR-155是否参与肾癌的发生、发展过程及在肾癌中的作用机制,目前相关研究较少。
  本研究采用RT-PCR技术检测肾癌及癌旁正常组织中miR-155的表达,结果显示,在肾癌组织中miR-155表达显著高于癌旁正常组织,差异有统计学意义,由此推测miR-155的过度表达可能与肾癌的发生、发展密切相关,同时也为肾癌的早期诊断、预后评估以及治疗提供了一定依据,进一步深入分析发现,miR-155的表达与肾癌的病理分级、分化程度、肿瘤大小、年龄等均无关。提示miR-155表达可能与肾癌病理分级及临床分化程度及肿瘤大小均无明显关系。但是由于本实验样本量不大,因此尚不能肯定miR-I55的表达与的病理分级、临床分化程度无关。同时本研究中患者术前通过影像学检查未查出淋巴结转移及远处转移,术中也没有检出局部淋巴结转移,今后研究需加大样本,进一步完善此类不足。
  miR-155在肾癌组织中表达含量升与那些因素的相关,以及miR-155表达升高后通过调控那些因子来影响肾癌的发生、发展是下一步的研究重点。可以预见,当能够阐明miRNA参与肾癌的发生过程,分析肾癌发展的分子生物学机制,将会对肾癌的诊疗起重要作用,也将带来更广阔的临床应用前景。
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