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外周血总及诱导痰在反复喘息婴幼儿喘息评估中的临床


  马前进 武怡 陈韬
  [摘要]目的 探討外周血嗜酸性粒细胞(EOS)、总IgE、白细胞介素10(IL-10)及诱导痰EOS在反复喘息婴幼儿喘息评估中的临床意义。方法 随机选取2016年2月~2017年12月邳州市人民医院收治的40例反复喘息婴幼儿作为研究对象,根据哮喘预测指数(API)将其分为API阳性组(n=20)和API阴性组(n=20)。同期随机选取于邳州市人民医院健康体检的20例婴幼儿作为对照组(n=20)。采用电化学发光法检测血清总IgE水平,采用化学发光法检测血清IL-10水平,采用HE染色法进行外周血EOS计数,并检测诱导痰EOS比例。结果 API阳性组患儿的外周血EOS计数、T-IgE水平及诱导痰EOS比例均高于API阴性组和对照组,血清IL-10水平均低于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。API阴性组患儿的血清IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。API阴性组患儿的外周血EOS计数、T-IgE水平及诱导痰EOS比例与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。血清IL-10与总IgE、诱导痰EOS成负相关(r=-0.394,P<0.05;r=-0.659,P<0.05);总IgE与诱导痰EOS成正相关(r=0.492,P<0.05);外周血EOS与IL-10成负相关,与总IgE、诱导痰EOS均成正相关(r=-0.668,P<0.05;r=0.445,P<0.05;r=0.521,P<0.05)。结论 API阳性反复喘息婴幼儿的外周血EOS计数、T-IgE水平及诱导痰EOS比例升高以及IL-10水平降低,外周血EOS、T-IgE、诱导痰EOS以及IL-10的水平检测与API存在关联,在预测哮喘危险性中有较好的参考意义。
  [关键词]婴幼儿;反复喘息;白细胞介素10;免疫球蛋白E;嗜酸性粒细胞;诱导痰;哮喘预测指数
  [中图分类号] R725.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2018)10(a)-0129-04
  [Abstract] Objective To investigate the clinical significance of peripheral blood eosinophils (EOS), total IgE, interleukin-10 (IL-10) and induced sputum EOS in wheezing assessment of recurrent wheezing infants. Methods A total of 40 cases of recurrent wheezing infants treated in people′s hospital in Pizhou city from February 2016 to December 2017 were randomly selected as objects and divided into API positive group (n=20) and API negative group (n=20) according to the asthma prediction index (API). In the same period, altogether 20 healthy infants with the health checkup in people′s hospital in Pizhou city were randomly selected as control group (n=20). Serum total IgE levels were measured by electrochemiluminescence method. Serum IL-10 levels were detected by chemiluminescence method. Peripheral blood EOS counts and the proportion of induced sputum EOS were detected by HE staining. Results The peripheral blood EOS counts, T-IgE levels and the proportion of induced sputum EOS in the API positive group were higher than those in the API negative group and the control group, the level of serum IL-10 was lower than that in the API negative group and the control group, and the differences were statistically significant (P<0.05). The level of serum IL-10 in the API negative group was higher than that in the control group, and the difference was statistically significant (P<0.05). There were no significant differences in the peripheral blood EOS counts, T-IgE levels and the proportion of induced sputum EOS between the API negative group and the control group (P>0.05). Serum IL-10 was negatively correlated with total IgE and induced sputum EOS (r=-0.394, P<0.05; r=-0.659, P<0.05). Total IgE was positively correlated with induced sputum EOS (r=0.492, P<0.05). Peripheral blood EOS was negatively correlated with IL-10, and positively correlated with total IgE and induced sputum EOS (r=-0.668, P<0.05; r=0.445, P<0.05; r=0.521, P<0.05). Conclusion The peripheral blood EOS counts, T-IgE levels and the proportion of induced sputum EOS increase, and IL-10 levels decreas in infants with API positive recurrent wheezing. There is a correlation between the peripheral blood EOS, T-IgE, induced sputum EOS and IL-10 levels and API, which has a good reference value in predicting the risk of asthma.
  [Key words] Infants and young children; Recurrent wheezing; Interleukin 10; Immunoglobulin E; Eosinophils; Induced sputum; Asthma predictive index
  反复喘息在婴幼儿呼吸系统症状中比较常见,部分患儿日后有可能发展成支气管哮喘,但喘息的次数并不是诊断哮喘的必要条件。有学者认为,要想区分婴幼儿第1次或仅有的1次喘息和之后多次喘息中的第1次几乎是不可能的[1]。目前尚无确切的方法预测哪些反复喘息的患儿有可能会发展成哮喘。哮喘预测指数(API)能有效地预测3岁以内反复喘息患儿发展成哮喘的危险性[2],目前建议API阳性的婴幼儿按哮喘规范治疗[3]。有研究表明IL-10与哮喘发病密切相关,IgE和嗜酸性粒细胞(EOS)在哮喘的发生发展过程中发挥重要作用。本研究通过检测反复喘息婴幼儿的外周血EOS计数、总IgE、IL-10及诱导痰EOS比例与哮喘的关系,探讨婴幼儿反复喘息的发病机制,从而为早期诊断哮喘并进行干预提供一定的理论依据。
  1资料与方法
  1.1一般资料
  随机选取2016年2月~2017年12月邳州市人民医院收治的40例反复喘息婴幼儿作为研究对象。纳入标准:①年龄6个月~3岁;②患儿临床表现为咳嗽、喘息,肺部可闻及呼吸相哮鸣音;③患儿在过去12个月内至少有3次喘息发作[4]。排除标准:气道异物、胃食管反流、支气管淋巴结核、先天性血管环畸形及先天性气道疾病等引起的喘息者。API阳性指喘息婴幼儿在过去1年内喘息≥4次,具有1项主要危险因素或2项次要危险因素。主要危险因素包括:①父母有哮喘病史;②经医师诊断特应性皮炎;③有吸入变应原致敏的依据。次要危险因素包括:①有食物变应原致敏的依据;②外周血EOS≥4%;③排除上呼吸道感染引起的喘息[5]。根据API将其分为API阳性组(n=20)和API阴性组(n=20)。其中,男22例,女18例;年龄6个月~3岁,平均(1.8±0.6)岁。同期随机选取于邳州市人民医院健康体检的20例婴幼儿作为对照组(n=20)。三组婴幼儿均为足月儿,三组的一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准,所有婴幼儿家属均知晓本研究情况并签署知情同意书。
  1.2方法
  三组患儿均于早晨空腹抽取静脉血约5 ml,37℃水浴,半小时后,以3000 r/min的转速离心15 min,分离血清,置于-70℃冰箱里保存。采用电化学发光法检测血清总IgE水平,试剂为罗氏原装试剂,仪器为罗氏E602,正常参考值为0~15 KIU/L。采用化学发光法检测血清IL-10水平,试剂为西门子原装试剂,按照试剂盒说明书执行操作。采集患儿的无名指末端血,采用HE染色法进行外周血EOS计数,并檢测诱导痰EOS比例。痰液诱导按照欧洲呼吸协会诱导痰液指导小组的指南并加以改进[6]。患儿先进行清洁口鼻,然后再吸入200 μg的沙丁胺醇,氧驱动雾化,流量约4 L/min,吸入3%高渗盐水,诱导20~30 min,由护士严格按正规操作规范吸痰,医师在场,严密观察患儿的面色、口唇、呼吸频率等情况,并收集痰液于无菌、干净的带刻度容器中。如果吸入30 min后还没有痰液导出则停止操作。收集的痰液均在1 h内处理,在处理前先置入4℃冰箱中保存。痰液处理:①先挑取含有黏液的痰栓,合格痰液是在显微镜下观察到鳞状上皮细胞数少于5%并见到肺巨噬细胞;②痰液先称重,加入大约4倍痰量的0.1%二硫苏糖醇,并在旋涡式混合器上进行混匀;③在37℃恒温水育箱里孵育15 min;④加入大约4倍痰量的磷酸盐缓冲液后继续水浴5 min;⑤将稀化的痰液先经过48 μm尼龙膜进行过滤,然后离心机以2000 r/min的转速离心10 min,并收集上清液放入-70℃冰箱中冷冻保存;细胞成分重悬于磷酸盐缓冲液中,涂片2张,并进行编号。痰液染色:将涂片先自然干燥,然后放入二甲苯内2 min,再移到装有无水酒精的器皿内2 min,取出排液后放入90%酒精1 min,再移到苏木素染液内静置半小时,然后放入冲洗盆内冲洗10 min,使粉红色变成蓝色。在盐酸酒精内浸渍涂片,并摇动数秒,再次冲洗使涂片变成蓝色。随后将涂片移至0.1%伊红液内2 min,对比染色,再次冲洗涂片3 min,分化伊红。取出排液,并移至90%酒精内摇振15 s,再移到无水酒精Ⅰ内摇振15 s,再移到无水酒精Ⅱ内摇振30 s。再将涂片移至二甲苯Ⅰ内15 s,再移至二甲苯Ⅱ内15 s,取出后封固。最后痰液分类计数由检验科医师在高倍显微镜下观察约400个有核细胞,其中包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞,然后计算出EOS比例(%)。
  1.3统计学方法
  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,方差不齐时两组间比较采用Dunnett-t检验,各个指标之间的相关性分析采用Spearman相关分析法,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2结果
  2.1三组患儿外周血EOS、IL-10、T-IgE及诱导痰EOS的比较
  API阳性组患儿的外周血EOS计数、T-IgE水平及诱导痰EOS比例均高于API阴性组和对照组,血清IL-10水平均低于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。API阴性组患儿的血清IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。API阴性组患儿的外周血EOS计数、T-IgE水平及诱导痰EOS比例与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
  2.2相关性分析
  血清IL-10与总IgE、诱导痰EOS成负相关(r=-0.394,P<0.05;r=-0.659,P<0.05);总IgE与诱导痰EOS成正相关(r=0.492,P<0.05);外周血EOS与IL-10成负相关(r=-0.668,P<0.05),与总IgE、诱导痰EOS均成正相关(r=0.445,P<0.05;r=0.521,P<0.05)。
  3讨论
  支气管哮喘是儿童期最常见的慢性疾病,我国流行病学调查发现80%以上的哮喘起始于3岁前。因此从反复喘息的婴幼儿中把可能发展为持续性哮喘的患儿识别出来并进行有效的早期干预非常必要[7]。但目前为止尚无特异的检测指标和方法用于诊断婴幼儿哮喘。美国学者根据图森的研究表明,3岁内API阳性的喘息患儿,到6~13岁时仍有喘息的阳性预测值可高达77%。目前我国尚缺乏婴幼儿的相关资料,因此,有必要尽快在我国开展儿童喘息性疾病相关的前瞻性队列研究,并建立更适合于中国儿童的API,以指导临床实践[8]。
  IL-10是近年发现的一种同型二聚体细胞因子,并有着广泛的免疫学效应,可由T淋巴细胞(Th0、Th1、Th2、CD4+、CD8+)、B细胞、肥大细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞等产生,属长链细胞因子家族[9]。有研究表明,IL-10能够抑制EOS的浸润及Th2细胞因子的产生从而抑制哮喘的发作,或在哮喘发病中起免疫抑制作用[10]。国内研究发现,哮喘发作期IL-10可为高或低表达[11]。当病原微生物袭击机体时,一方面产生IL-6、TNF-α等炎性因子来清除病原体,从而促进组织的修复;另一方面机体又通过释放IL-10等抑炎因子来下调或平衡炎性反应[12]。近年来提出的调节性T淋巴细胞及相关细胞因子IL-10在支气管哮喘的发病中起重要作用[13]。本研究结果提示,API阳性组患儿的血清IL-10水平均低于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),与哮喘发作期一致,进一步证实了反复喘息与血清IL-10密切相关。可以推断IL-10的缺乏可能是导致喘息发作的重要因素之一。
  EOS是引起气道高反应和气道炎症的主要细胞,在哮喘发病中发挥着重要的作用[14],EOS能够释放多种毒性蛋白和炎性介质,从而在婴幼儿喘息的形成和发展中起重要作用。本研究将3岁以下喘息患儿分为API阳性组与API阴性组,研究结果提示,API阳性组患儿的外周血EOS计数均明显高于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示API阳性组在免疫学发病机制上,与哮喘相似或相同,有可能就是哮喘的早期表现。而API阴性组患儿的外周血EOS计数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),推测API阴性组可能与病毒感染相关。由于EOS在某些血液疾病或传染性疾病中也会异常升高,而且还存在昼夜变化,因此仅靠EOS计数升高不能诊断哮喘[15]。另外本研究结果提示,API阳性组的外周血EOS计数与IL-10成负相关,提示两者可能存在一定关系,但具体通过什么途径互相影响尚需要探讨。
  IgE在呼吸道变应性炎症的触发因素中,起着关键作用。有研究表明,哮喘是在IgE介导下的Ⅰ型变态反应,IgE水平的升高和哮喘的严重程度有着密切关系[16]。在气道炎症的病理变化中,IgE起到了介導Ⅰ型超敏反应的作用[17]。本研究结果提示,API阳性组患儿的血清IgE水平均高于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),与哮喘在免疫学发病机制上很相似。另外病毒感染也是引起患儿反复喘息的常见原因之一,目前尚不清楚是病毒感染后气道功能受到损伤导致哮喘易感,还是免疫反应和气道发育等特点使婴幼儿易发生反复喘息和哮喘[18-19]。本研究结果提示,API阴性组患儿的T-IgE水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),推测其喘息发作可能与呼吸道病毒感染有关。
  诱导痰检测是近年来研究呼吸道疾病的无创诊断手段之一,其能够较好地反映支气管、气管的病理改变,可以和支气管镜检查相媲美。本研究检查了API阳性组患儿、API阴性组患儿及健康婴幼儿的诱导痰EOS分类,结果提示,API阳性组患儿诱导痰EOS比例均高于API阴性组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),与哮喘是以慢性气道炎症为主要特征的常见病、多发病,有多种细胞参与其炎症过程,而其中EOS被认为是导致支气管黏膜损伤和功能障碍的重要炎症细胞[20-23]相符。另外本研究结果提示,总IgE与诱导痰EOS成正相关,从而间接提示个体特异质与喘息发病的相互关系。
  综上所述,API阳性喘息的婴幼儿的总IgE、诱导痰EOS比例及外周血EOS计数均高于API阴性组和对照组,血清IL-10水平低于API阴性组和对照组,外周血EOS与总IgE成正相关,故其发病机制和支气管哮喘相似,倾向机体过敏因素,从而对于该部分患儿,应该按照哮喘进行干预治疗。
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