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脂联素对糖尿病伴发急性脑缺血大鼠的神经保护作用


  【摘 要】目的:探討脂联素对糖尿病伴发局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用及可能机制。方法:取SD雄性大鼠45只,制作糖尿病大鼠,并在此基础上制作急性局灶性脑缺血模型,后大鼠随机分成3组,分别为手术组、对照组实验组干预后2周首先使用改良神经功能缺损(mNSS)量表评价各组大鼠神经功能缺损情况。激光共聚焦观察各组大鼠缺血区微血管直径、密度和总面积。ELISA法检测血浆和局部脑组织的血管内皮生长因子表达情况。结果:(1)mNSS评分:实验组较对照组组明显降低。(2)三维共聚焦显示:实验组血管直径明显小于假手术组及对照组;实验组较对照组血管密度显著增多,实验组的微血管总面积显著大于对照组。(3)ELISA法结果显示:实验组大鼠血浆VEGF浓度显著高于对照组。结论:脂联素具有明显的神经保护作用,其可能与VEGF有关。
  【关键词】脂联素;糖尿病;卒中;神经保护;血管内皮生长因子
  脂联素(Adiponectin,APN)是常见的脂肪因子之一,主要由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白,具有调节糖脂代谢、抗炎、抗动脉粥样硬化、促进血管内皮细胞的增殖和迁移等多种作用,在缺血性脑血管病中有着广泛的应用前景 [1-2]。可惜的是至今为止,此类研究较少。为此,本课题选用在糖尿病模型基础上,首先制备MCAO(缺血再灌注模型)大鼠,后给予APN干预,2周后观察各组大鼠的神经功能恢复情况,同时通过检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况来探讨其可能的分子生物学机制,为ICD的治疗提供新的思路。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物与模型的制备和分组
  从武汉大学动物实验中心购得雄性SD大鼠60只,SPF级, 8~12周,体重180-220g。分笼饲养于江汉大学动物实验中心饲养。
  采用高脂高糖饮食加腹腔注射链脲佐菌素的方法制备2型糖尿病动物模型,后采用改良Longa-Zea线栓法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型[3]。所有实验大鼠随机分成3组,分别为假手术组(sham组)、对照组(MCAO+生理盐水)、实验组(MCAO+APN干预),每组15只大鼠。所有干预措施采用腹腔注射,实验组将APN注射到大鼠体内,对照组以同等生理盐水注入,连续干预14天。
  1.2 神经功能缺损评分
  采用改良的大鼠神经功能缺损评分量表(mNSS)[3]。分别在术前1d、术后14d进行,评分3~14分的动物入组。
  1.3 共聚焦三维脑血管成像
  于造模后14d,每组分别取6只采用振动切片机冠状切片,选取视交叉部位,向大脑端连续切片,片厚100?m。用激光扫描共聚焦显微镜扫100个层面,分析各组大鼠血管形态、内径、密度及单位面积荧光物质点数。
  1.4 ELISA法检测血浆VEGF浓度
  干预后14d,每组分别取6只大鼠静脉外周血,应用酶联免疫吸附法检测血浆VEGF水平,具体操作过程依照试剂盒说明书进行。
  1.5 统计学分析
  各组数据以均数±标准差()表示,两样本间比较采用配对t 检验,组间比较采用单因素方差分析。所有统计计算由SPSS13.0软件完成,以P<0.05表示存在统计学差异。
  2 结果
  2.1 大鼠的神经功能缺损评分
  (1)模型制作前1d,假手术组、对照组、实验组mNSS评分分别为(1.60±0.08)分、(1.63±0.43) 分和(1.63±0.63)分,组间无显著性差异(F=0.70,P>0.05),术前各组大鼠的生理实验基础基本相同,各组具有可比性。
  (2)术后3d对照组、实验组在模型制作后均出现明显的神经功能缺损,mNSS评分分别为(10.03±0.44)分和(10.74±0.37)分,与假手术组(2.03±0.36)分相比,均出现显著性差异(F= 864.46,P<0.01)。
  2.2 三维共聚焦血管成像
  实验组的毛细血管直径(2.93±0.49) ?m 较假手术组(4.44±0.16)?m和对照组(3.56±0.42)?m明显减少(F=104.242,P<0.01);实验组的血管密度(234.68±14.64)个/0.002 mm3较假手术组(130.88±6.34)个/0.002 mm3及对照组(176.26±10.87)个/0.002 mm3均有显著增大(F=290.49,P<0.01);
  2.3 血浆VEGF浓度
  术后14d,用酶联免疫吸附法测得假手术组、对照组和实验组大鼠血浆VEGF浓度,分别为4.49±0.78、13.76±4.04、50.35±6.44pg/ml,三组间存在显著性差异(F=436.04,P<0.01)。其中,对照组(P=0.004)和实验组(P=0.002)显著性高于假手术组,而实验组也显著性高于对照组(P=0.001)。
  3 讨论
  本研究发现,在大鼠干预后发现对照组、实验组大鼠均出现明显的功能缺损,但是对照组大鼠的脑损伤程度较重。说明APN可以有效的减轻脑缺血大鼠神经功能受损。进一步的我们观察了APN对急性脑缺血大鼠的血管形成影响,发现实验组大鼠的血管密度明显增加,血流恢复较快,而对照组的血管密度与两个实验组相比却有很大的差异(P<0.01)。这表明,APN可以促进缺血区大脑的血管新生,其可能与脑缺血区域的微环境能够促进血管内皮细胞的迁移和存活并分化形成新生血管有关。
  为了进一步探索APN的分子生物学机制,我们检测了血管内皮生长因子(VEGF)这种经典的血管生成因子。结果发现与对照组相比,实验组大鼠的血浆VEGF水平明显增加(P<0.05)。我们知道,血管的生成主要包括血管新生和血管发生,而这两个过程均与血管生成因子密切相关,尤其是在脑缺血发生后会反应性增加,改善脑卒中预后[2,4]。其中VEGF是已知的最经典的血管生成因子之一,在血管生成过程中,它与其受体VEGFR结合,促进内皮增殖、黏附、迁移[3,5],启动血管新生,发挥其生物学功能,并促进神经元生长。经过研究证实,增加脑缺血组织的局部VEGF浓度,可刺激缺血附近的微血管生长和侧支循环形成,从而达到脑缺血损伤的保护作用[3]。而且VEGF在啮齿类动物海马脑区的高亲和力的Flk-1受体结合后,促进海马小胶质细胞内 VEGF-mRNA的高表达,发挥神经保护效应[6]。另最近有研究表明,VEGF不仅具有促进血管新生作用,还可发挥多效性神经保护因子的作用[7]。
  由此我们推测,APN能够减轻脑缺血再灌注大鼠的神经损伤和改善神经功能,机制可能与VEGF介导的血管新生有关。
  (通讯作者:朝浩)
  参考文献
  [1]孔朝红,刘煜敏,朱江等.自体骨髓来源内皮祖细胞移植改善脑缺血再灌注大鼠神经功能转归 [J].国际脑血管病杂志,2012,20(4):258-260.
  [2]Lim CM, Kim SW, Park JY, et al. Fluoxetine affords robust neuroprotection in the postischemic brain via its anti-inflammatory effect. [J].Neurosci. Res. 2009, 87(4): 1037-1045.
  [3]Kong Z, Hong Y, Zhu J, et al. Endothelial progenitor cells improve functional recovery in focal cerebral ischemia of rat by promoting angiogenesis via VEGF.J Clin Neurosci. 2018,55:116-121.
  [4]Hagg T. From neurotransmitters to neurotrophic factors to neurogenesis[J].Neuroscientist. 2009,15(1) ,20-27.
  [5]Wang L,Zeng H,Wang P,et a1.Neuropilin-1-mediated Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor-dependent Endothelial Cell Migration[J].Bio1 Chem,2003,278(49):48848-48860.
  [6]Warner Schmidt JL, Duman RS. VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(11): 4647-4652.
  [7]Namieeinska M, Mareiniak K, Nowak JZ. VEGF as an angiogenic neurotrophic and neuroprotective factor [J]. Postepy Hig Med Dosw,2005,59(1): 573-583.
  作者簡介
  尹晓新,主任医师,教授,硕士研究生导师,副院长,武汉科技大学附属汉阳医院神经内科。
  朝浩,副主任医师,副教授,神经内科科室主任,武汉科技大学附属汉阳医院神经内科。
  杨涛,副主任医师,副教授,武汉科技大学附属汉阳医院神经内科。
 
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